由 Mike Browning 和 Amy Archuleta 提供

對(duì)于蛋白質(zhì)，形成 IS 函數(shù)。

蛋白質(zhì)做它們做的事是因?yàn)樗鼈兊男螤睢＝Y(jié)構(gòu)蛋白不斷發(fā)揮作用以支撐細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其他蛋白質(zhì)介導(dǎo)的生物功能（例如細(xì)胞分裂）必須根據(jù)細(xì)胞需要進(jìn)行調(diào)節(jié)和關(guān)閉。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其活性的主要細(xì)胞機(jī)制。當(dāng)?shù)鞍准っ笇⒘姿釓?ATP 轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基時(shí)，就會(huì)發(fā)生蛋白磷酸化。添加帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)會(huì)改變目標(biāo)蛋白質(zhì)的形狀，從而改變其功能。

磷蛋白被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)之一。

磷蛋白是調(diào)節(jié)幾乎所有細(xì)胞過程的蛋白質(zhì)，從癌癥中的細(xì)胞分裂到學(xué)習(xí)和記憶中的神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于磷蛋白幾乎調(diào)節(jié)所有重要的細(xì)胞功能，我們喜歡說“磷蛋白是蛋白質(zhì)組學(xué)語言的動(dòng)詞”。分析特定蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的能力對(duì)于確定給定蛋白質(zhì)的功能以及該活性如何受細(xì)胞信號(hào)影響的探索非常有用。此類檢測對(duì)于鑒定可影響磷酸化并因此影響特定蛋白質(zhì)功能的藥物也至關(guān)重要。

需要一種方法來跟蹤蛋白質(zhì)的活性，而不僅僅是其表達(dá)水平。

為了形象化這種工具的重要性，想象一個(gè) FBI 特工坐在車?yán)锉O(jiān)視房子里的嫌疑R。特工可能無法看到嫌疑R在哪個(gè)房間或他們?cè)谧鍪裁础⑵渑c房屋內(nèi)裝有攝像機(jī)的代理進(jìn)行對(duì)比。同樣，磷酸化特異性抗體不僅表明存在蛋白質(zhì)，還表明蛋白質(zhì)是否具有活性。

磷蛋白檢測的歷史始于放射性。

不幸的是，在早期研究中可視化磷蛋白需要用32 P對(duì)磷酸基團(tuán)進(jìn)行放射性標(biāo)記。 這是勞動(dòng)密集型的：實(shí)際上有數(shù)千種蛋白質(zhì)被磷酸化（并結(jié)合32 P），因此需要免疫沉淀將感興趣的蛋白質(zhì)與所有其他標(biāo)記的蛋白質(zhì)分開蛋白質(zhì)。然而，即使進(jìn)行免疫沉淀并分離出感興趣的蛋白質(zhì)，也無法確定蛋白質(zhì)上的哪個(gè)位點(diǎn)已被磷酸化。這是至關(guān)重要的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)上的某些位點(diǎn)可以打開它，而其他位點(diǎn)可以關(guān)閉它。此外，32 P 研究很難量化，因?yàn)閮H代謝變化就可以改變32P 級(jí)別的標(biāo)記。最后，由于無法在體內(nèi)用32 P標(biāo)記，體內(nèi)磷酸化的研究實(shí)際上是不可能的。

幾十年前，磷酸化特異性抗體的開發(fā)始于針對(duì)磷酸酪氨酸的抗體。

產(chǎn)生磷酸化依賴性抗體的第一份報(bào)告出現(xiàn)在 1981 年，當(dāng)時(shí)通過將膦酸芐酯注射到兔子體內(nèi)產(chǎn)生了可以檢測含磷酸酪氨酸蛋白的抗體 (1)。這些抗體成為癌癥研究的關(guān)鍵試劑，但在許多蛋白質(zhì)上檢測到磷酸酪氨酸。此類抗體的主要缺點(diǎn)不僅在于它們檢測許多不同蛋白質(zhì)的磷酸化，而且與32P 研究，他們經(jīng)常檢測同一蛋白質(zhì)上的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。本質(zhì)上，此類抗體顯示磷酸化正在發(fā)生，但無法識(shí)別哪些蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)上的哪些位點(diǎn)被磷酸化。還進(jìn)行了許多嘗試以產(chǎn)生檢測磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的抗體，但這些方法大體上不是很成功。

使用全長蛋白質(zhì)作為抗原更有針對(duì)性，但仍然存在問題。

在這項(xiàng)初步工作后不久，Nairn 及其同事描述了一種特異性針對(duì) G 底物磷酸化形式的抗體的產(chǎn)生，G 底物是一種定位于小腦浦肯野細(xì)胞并被 cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化的蛋白質(zhì) (2)。該抗體是通過體外磷酸化的純化G-底物磷蛋白對(duì)家兔進(jìn)行免疫接種而制備的。. 盡管取得了初步成功，但通過用完整蛋白質(zhì)的磷酸形式免疫來生產(chǎn)磷酸特異性抗血清的其他嘗試并不十分成功，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)重要因素。首先，據(jù)信許多磷酸化蛋白質(zhì)在免疫過程中會(huì)快速去磷酸化，無論注射途徑如何，都會(huì)導(dǎo)致所需磷酸化表位的丟失。其次，全蛋白通常含有多個(gè)免疫原性表位。由于磷酸位點(diǎn)只是這種長蛋白質(zhì)的一小段，因此針對(duì)全長蛋白質(zhì)抗原的抗體識(shí)別感興趣的磷酸位點(diǎn)的可能性很低。

生成位點(diǎn)特異性磷酸化抗體的更直接方法是利用合成肽的磷酸化形式。

由緊鄰感興趣的磷酸化氨基酸周圍的 15-20 個(gè)氨基酸組成的短肽將免疫反應(yīng)集中在特定磷酸位點(diǎn)上。此外，這些短肽通常對(duì)去磷酸化具有抗性。然而，這不是絕對(duì)的，因?yàn)槟承╇拇_實(shí)會(huì)去磷酸化。這也導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)非磷酸化肽的抗體。因此，必須純化這些肽免疫后收集的血清，以將磷酸肽抗體與識(shí)別 dephopsho 肽的抗體分離。

磷酸化和去磷酸化肽在磷酸化特異性抗體的純化中非常有用。

我們的一位聯(lián)合創(chuàng)始人：Andy Czernik 和他的同事 (3) 制定了生產(chǎn)磷酸化狀態(tài)特異性抗體的通用方案。通過連續(xù)層析，首先通過將血清通過與用作抗原的磷酸化肽結(jié)合的柱子，從去磷酸化抗體中積極地選擇磷酸化抗體。此步驟之后是在與去磷酸化形式的肽結(jié)合的柱上進(jìn)行負(fù)選擇。可以在我們的網(wǎng)站上找到此純化程序的詳細(xì)信息。

今天的磷酸化特異性抗體僅在蛋白質(zhì)處于磷酸化狀態(tài)時(shí)與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。

通過這種革命性免疫化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以開發(fā)磷酸化特異性抗體，用于確定特定蛋白質(zhì)上特定位點(diǎn)的磷酸化水平。它們更容易使用，因?yàn)榭贵w只標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)。IP 不需要分離其他蛋白質(zhì)，也不需要使用32 P 標(biāo)記。因此，抗體可用于 WB 和 IHC，以顯示目標(biāo)蛋白特定位點(diǎn)磷酸化的相對(duì)強(qiáng)度。此外，當(dāng)該抗體用于 IHC 時(shí)，可以識(shí)別其中蛋白質(zhì)已被激活的特定細(xì)胞。我們將在我們的博客中討論在 IHC 中使用磷酸化特異性抗體。

對(duì)磷蛋白功能的了解導(dǎo)致了癌癥治療的巨大進(jìn)步。

磷酸化特異性抗體*改變了蛋白質(zhì)磷酸化的研究，并幫助了許多針對(duì)磷蛋白治療疾病狀態(tài)的新藥的開發(fā)。影響磷酸化的藥物在癌癥治療中得到*泛的應(yīng)用和研究。最常見的磷酸化相關(guān)藥物是小分子激酶抑制劑。此類抑制劑占當(dāng)前藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)工作的近四分之一。抑制不同的激酶信號(hào)通路對(duì)非癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，從而影響對(duì)癌細(xì)胞的選擇性殺傷，毒性較小 (4)。

超越蛋白質(zhì)印跡：IHC 和 IF 的未開發(fā)機(jī)會(huì)。

磷酸化特異性抗體廣泛用于磷酸化蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。然而，在免疫組織化學(xué)的奇妙世界中，這些抗體的使用卻少得多。鑒于此類研究可以提供有關(guān)磷蛋白的細(xì)胞和亞細(xì)胞定位的明顯細(xì)節(jié)，因此缺乏使用 IHC/IF 的研究是不幸的。在 PhosphoSolutions，我們竭盡全力驗(yàn)證我們的許多 IHC/IF 磷酸化抗體。此外，我們還寫了一章討論這些抗體在 IHC/IF 中的使用。在隨后的博客中，我們將討論在 IHC/IF 中使用磷酸化抗體的最佳實(shí)踐。

來自我們創(chuàng)始人 Mike Browning 的最后個(gè)人筆記

多年前我開始讀研究生時(shí)，只知道 2 種蛋白激酶。今天我們知道人類基因組編碼超過 500 種激酶。盡管如此，發(fā)現(xiàn)這個(gè)迷人的世界還是非常令人興奮的，在這個(gè)世界中，蛋白質(zhì)可以像燈泡一樣被關(guān)閉和重新打開。當(dāng)我得知這個(gè)過程時(shí)，就像一個(gè)燈泡在我腦海中閃過。我正在研究腦細(xì)胞信號(hào)的可塑性方式，即它可以打開和關(guān)閉，甚至可以像立體聲音響上的音量控制一樣上下。就在我面前的是支持大腦可塑性的分子機(jī)制：塑料蛋白！我被迷住了，從那以后一直如此。謝天謝地，有磷酸抗體，否則我現(xiàn)在可能會(huì)對(duì)32 P產(chǎn)生放射性。